脊髓损伤（SCI）是一种致残性的疾病，可能导致永久性的功能丧失和运动障碍。大量研究表明溶酶体膜通透化（lysosomal membrane permeability，LMP）在脊髓损伤中发生，引起溶酶体组织蛋白酶外渗到细胞质，影响溶酶体功能，从而导致神经元自噬体的积累以及自噬流的受损。倪文飞研究团队既往综述过胞浆磷脂酶A2（cytosolic phospholipase A2，cPLA2）作为神经炎症的主要介质，在病理情况下分解溶酶体sn-2位置的膜磷脂，产生溶血磷脂和ω3-多不饱和脂肪酸，从而引起LMP，产生脊髓损伤的炎症环境[1]。因此，靶向cPLA2来稳定溶酶体膜通透性可能是一种治疗脊髓损伤新的策略然而，由于血脑屏障的存在，一般药物的有效成分无法到达脊髓损伤区域。线粒体靶向抗氧化肽（Elamipretide，又称SS-31）是一种新型的芳香族阳离子肽，由于其芳香基团和阳离子交替的结构，它可以自由地通过血脑屏障到达神经损伤部。研究证实，SS-31能抑制神经退行性疾病中神经元氧化应激，减轻神经炎症介质和毒性蛋白的积累，具有抗炎，抗细胞焦亡，促进神经元存活的疗效[2-4]。此外，SS-31能借助其阳离子结构广泛富集于线粒体带阴离子的心磷脂内膜中，增强线粒体呼吸，激活神经线粒体生物发生，增强线粒体自噬[5]。在细胞自噬过程中，线粒体和溶酶体细胞器之间存在紧密的互作联系。然而，线粒体靶向抗氧化肽（SS-31）是否也能通过稳定溶酶体膜通透化，以抑制细胞焦亡，促进脊髓损伤的神经修复，尚不得而知。2023年1月7日，温州医科大学附属第二医院骨科/浙江省骨科学重点实验室在Journal of Neuroinflammation上发表了题为“Elamipretide alleviates pyroptosis in traumatically injured spinal cord by inhibiting cPLA2-induced lysosomal membrane permeabilization”的文章，采用小鼠脊髓挫伤模型开展了一系列研究，明确了SS-31改善脊髓损伤小鼠炎症环境促进脊髓损伤功能恢复，并首次发现SS-31通过p38-MAPK信号通路抑制胞浆磷脂酶A2（cPLA2）的磷酸化水平来改善溶酶体膜通透性，从而改善神经细胞焦亡以及自噬流受损，以促进脊髓损伤小鼠的神经修复。张豪杰、陈逸拓和李飞达为论文共同第一作者，周凯亮副教授和倪文飞主任为论文共同通讯作者。（拓展阅读：周凯亮/倪文飞课题组相关工作，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：J Neuroinflammation 综述︱倪文飞/周凯亮团队聚焦STING通路在CNS损伤后神经炎症及细胞死亡中的重要作用）首先，作者根据SS-31在神经疾病中应用的既往研究[4]，确定给药剂量和给药时间，并于脊髓损伤后的连续三天内在SS-31组小鼠腹腔每日注射5 mg/kg剂量的SS-31，而Sham组和SCI组小鼠腹腔注射相同体积的DMSO。免疫荧光、HE/Masson染色以及步态分析结果显示SS-31可以减少脊髓损伤后28天小鼠的神经胶质瘢痕面积和神经元死亡数量，重建突触之间的连接，并改善脊髓损伤后的运动恢复（图1A-K）。此部分研究表明SS-31有效促进了脊髓损伤小鼠的组织学和功能学的恢复。（图源：Zhang H, et al., J Neuroinflammation, 2023）
Caspase-1依赖的经典细胞焦亡途径在脊髓损伤亚急性期发生[6]。焦亡最终导致GSDMD的分裂，其N端片段在细胞膜内形成10-15nm小孔，引起炎症因子释放，细胞肿大，膜破裂诱发细胞死亡。既往研究证实SS-31能减弱LPS诱导的髓核细胞焦亡以及老年小鼠围手术期焦亡水平，那SS-31是否也能抑制脊髓损伤小鼠的焦亡？本项研究采用Western Blot、免疫荧光染色检测脊髓损伤小鼠体内及神经元焦亡水平。结果显示SS-31有效抑制了神经元的焦亡（图2A-FD）。图2 SS-31抑制脊髓损伤小鼠神经元的焦亡水平
（图源：Zhang H, et al., J Neuroinflammation, 2023）
细胞自噬作为一种神经元促生存机制，可以通过调控神经细胞死亡来提供神经保护[7]。为了验证SS-31对脊髓损伤后神经自噬活性的影响，作者采用PCR、Western Blot及免疫荧光染色检测了脊髓损伤后3天自噬体蛋白(Beclin-1、VPS34和LC3)、溶酶体生物发生相关生物标志物(ATP6V1B2和LAMP1)和自噬底物蛋白(SQSTM1/p62)的蛋白水平以及Sqstm1的基因水平。结果表明脊髓损伤能导致自噬流受损，而SS-31缓解了自噬流的阻断（图3A-G）。（图源：Zhang H, et al., J Neuroinflammation, 2023）为了进一步明确SS-31对脊髓损伤后自噬和焦亡的相互作用关系，作者采用了自噬流阻断剂氯喹（CQ），并通过Western Blot和免疫荧光检测Sham组，Sham+CQ组，SCI组，SCI+SS-31组及SCI+SS-31+CQ组中神经元的焦亡以及自噬水平。结果显示，CQ在一定程度上逆转了SS-31对脊髓损伤后的焦亡抑制作用，表明SS-31通过改善自噬流抑制焦亡（图4A-J）。（图源：Zhang H, et al., J Neuroinflammation, 2023）溶酶体膜通透化（LMP）是诱导神经细胞焦亡的重要信号通路[1]。此外，LMP升高的溶酶体会损害神经疾病中的自噬流并导致神经元自噬体的异常积累。鉴于此，作者通过脊髓组织亚细胞分离技术收集了溶酶体富集组分。用Western Blot和免疫共定位荧光确定溶酶体酶的分布。用酶联免疫吸附实验测试溶酶体酶在不同组分的活性。一系列结果表明，脊髓损伤之后，因LMP增加溶酶体蛋白水解酶渗漏到细胞质中，而SS-31缓解LMP及溶酶体蛋白水解酶外渗（图5A-H）。在创伤性中枢神经损伤中，胞浆磷脂酶（cPLA2/Pla2g4a）的磷酸化水平上调能够导致溶酶体膜通透化[1]，并引起细胞焦亡及自噬流的抑制[6]。考虑到SS-31的上述作用，作者猜测SS-31是否能靶向cPLA2？Western Blot进一步检测了Sham组、SCI组和SCI+SS-31组中cPLA2和p-cPLA2的水平。结果显示，三组cPLA2表达量相当。然而，脊髓损伤显著上调了p-cPLA2和p-cPLA2/cPLA2比值，而SS-31减弱这种改变（图5I-M）。结果表明SS-31能够抑制脊髓损伤后神经元的cPLA2磷酸化水平。图5 SS-31改善溶酶体膜通透化，抑制神经元p-cPLA2的激活（图源：Zhang H, et al., J Neuroinflammation, 2023）本研究进一步验证SS-31在脊髓损伤中发挥的抑制焦亡，改善溶酶体膜通透性以及恢复自噬流的疗效是否是通过靶向cPLA2起作用，采用腺相关病毒AAV-Pla2g4a转染小鼠过表达Pla2g4a基因。相关拯救实验表明，SS-31降低cPLA2的磷酸化水平是SS-31改善溶酶体功能、抑制焦亡以及恢复自噬流的关键靶点（图6A-J及图7A-H）。图6 过表达Pla2g4a减弱SS-31对溶酶体膜通透化的抑制（图源：Zhang H, et al., J Neuroinflammation, 2023）图7 过表达Pla2g4a减弱SS-31对焦亡的抑制及自噬流的恢复（图源：Zhang H, et al., J Neuroinflammation, 2023）本研究进一步探究cPLA2上游信号，cPLA2序列的检测清晰地揭示这种酶包含一个共识磷酸化序列(包含Ser-505)，它是MAPK家族的作用靶点[8]。MAPK家族由三条信号通路构成：ERK1/2、p38和JNK信号通路。此外，研究表明SS-31能够在缺血再灌注模型中抑制p38-MAPK信号通路发挥抗炎作用[9]。本研究进一步采用Western Blot检测MAPK三大信号通路（p38/JNK/ERK1/2）的表达水平（图8A-B）。结果显示，SS-31能显著减弱脊髓损伤后p-p38的水平，而不影响p-JNK及p-ERK1/2。此外，作者应用积雪草酸（p38激动剂，AA）进一步验证p38是SS-31抑制cPLA2磷酸化的上游靶点。结果显示，SS-31能够通过抑制p38的磷酸化来抑制cPLA2从而改善焦亡，溶酶体功能以及自噬流的受损（图8C-E）。图8 p38是SS-31抑制cPLA2磷酸化的上游位点（图源：Zhang H, et al., J Neuroinflammation, 2023）图9 模式图：SS-31靶向MAPK-p38-cPLA2信号通路促进脊髓损伤恢复（图源：Zhang H, et al., J Neuroinflammation, 2023）文章结论与讨论，启发与展望综上所述，本研究采用传统脊髓挫伤模型,并通过腹腔注射线粒体靶向抗氧化肽（SS-31）来给予治疗。行为学上，作者使用BMS小鼠量表、步态分析和斜面试验评价脊髓损伤后个体的功能状况。组织学上，作者采用HE、Masson、MAP2和SYN染色确定脊髓胶质瘢痕面积、树突和突触数量。分子机制上，作者采用Western Blot、免疫荧光法(IF)检测焦亡、自噬相关蛋白的表达水平。此外，作者使用了溶酶体提取试剂盒并用超速离心的方法分离出了溶酶体组分和胞浆组分，并通过检测溶酶体及胞浆组分中组织蛋白酶的含量水平来验证溶酶体膜通透化的发生，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测不同组分中组织蛋白酶活性水平。上述实验中作者发现了SS-31能抑制胞浆磷脂酶A2（cPLA2）的磷酸化。因此，作者构建了AAV-Pla2g4a腺相关病毒来转染脊髓损伤小鼠，进一步验证SS-31的是否是借助cPLA2来发挥其在SCI小鼠的功效。最后，作者检测了MAPK信号通路中关键蛋白的表达，确定了SS-31靶向cPLA2发挥作用的信号通路。
同时，SS-31在临床应用之前，还需要对其进行更深入的研究：（1）由于SS-31是一种靶向线粒体的多肽，它可能在线粒体内膜内聚集1000倍以上。活性氧也是脊髓继发性损伤的重要机制。因此，SS-31对脊髓损伤中活性氧的影响有待进一步研究。（2）cPLA2诱导产生许多代谢物，包括花生四烯酸、前列腺素E2、溶血磷脂酸等，这些均可介导神经炎症。SS-31是否通过抑制cPLA2的下游产物发挥抗炎作用尚不清楚。（3）作者的结果表明SS-31抑制p38而不是JNK或ERK1/2信号通路。然而，先前的研究表明，一旦中枢神经系统受损，这三条信号通路就会协同作用，影响cPLA2的磷酸化。因此，与SS-31和其他特异性JNK或ERK1/2抑制剂联合治疗可能会切断cPLA2刺激的正反馈循环，并在脊髓损伤中产生附加或协同影响。（4）口服给药作为一种安全性高、依从性好的给药途径逐渐成为给药的主要途径。然而，胃肠道的结构和生理功能使得多肽药物口服后的生物利用度和半衰期较低。根据以往的研究，SS-31的给药途径通常是注射给药。在未来，SS-31可能与水凝胶混合，并直接给药到脊髓的受伤区域。这将使药物在很长一段时间内持续释放并发挥其作用。
总的来说，作者的研究为SS-31治疗SCI提供了新的临床前证据；而SS-31的SCI临床转化还需要进一步的研究推动。原文链接：https://doi.org/10.1186/s12974-023-02690-4 基金支持：国家自然科学基金面上项目（8207219），浙江省公益技术项目（LGF20H150003），浙江省自然科学基金（LY17H060009，Y21H060009），温州市科技局基金资助项目（Y20210438）。第一作者：张豪杰硕士（左一）、陈逸拓硕士（左二）、李飞达硕士（中）；通讯作者：倪文飞主任医师（右二）、周凯亮副教授（右一）。 学习资料【1】收藏+免费︱脑科学视频课程 & 9大手术造模和细胞分子科研手册资料
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